人B淋巴母细胞HMy2CIR培养指南

一、细胞培养条件

确保在适当的条件下培养细胞。收到细胞后，应立即处理，待培养至良好状态后，用完全培养液灌满瓶口并密封，这是运输细胞的最佳方式。使用75%酒精喷洒整体细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放置于37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态，然后进行后续处理。观察细胞生长情况，建议在不同倍数下拍照保存（最佳为40x、100x、200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，未提供照片默认为收到状态良好。传代后建议一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基，以便进行对比培养，并在换液后松开瓶盖。

二、细胞培养步骤

a. 细胞传代：如果细胞汇合度未超过80%，将瓶中的完全培养液收集中转至离心管中，留5ml完全培养基，并放入37℃、5% CO2孵箱培养；若细胞密度超过80%，则可进行传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁的PBS对此进行润洗1-2次。
2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞状态；若细胞多数呈圆形并开始脱落，迅速拿回操作台，轻轻敲击培养瓶后，加入5ml完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，确保其完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液以1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最终放置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存：当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗一次；接着添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养液终止消化，再轻轻吹打细胞使其脱落。将悬液转移至15ml离心管中，以1000rpm离心5分钟；弃去上清后，将沉淀细胞与1ml雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001）混匀后装入冻存管中。将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若后续需转入液氮罐中，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再进行转移。

c. 细胞复苏：从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速将其置于37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶后，用75%的酒精擦拭冻存管外壁；将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，在1000rpm下离心5分钟；弃去上清后，用5ml完全培养基重悬细胞，接种于T25培养瓶中，放入37℃、5% CO2细胞培养箱中继续培养；第二天更换新鲜的完全培养基以继续培养。

三、注意事项：某些细胞在运输过程中可能会因贴壁不牢而脱落，此现象为正常。如果脱落细胞较多，可将培养瓶内所有培养液收集至离心管中，进行1000rpm离心5分钟，然后收集上清作为过渡培养，并将沉淀加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟后再加入5ml完全培养基以终止反应，随后再离心，弃去上清，重新加入1-2ml完全培养基重悬。最终按1:2比例进行分瓶传代，补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后放置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

四、售后条款：细胞如出现问题，符合重发条件者包括1）细胞运输途中如丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等问题，均可重发；2）收到产品48小时内如出现细胞污染，需提供真实的实验结果进行核实后重发；3）常温发货细胞静置24小时后，干冰发货细胞复苏后24小时内绝大多数细胞未存活（需提供真实清晰的细胞状态照片）可重发；4）如干冰发货细胞复苏后24小时或常温发货细胞静置4小时后未开封出现污染，均可重发；5）收到细胞后7天内，如细胞活性有疑问，请使用台盼蓝染色法鉴定，结果核实后可重发；6）收到细胞当天以及第二、三天需拍照，若三天内未告知则视为产品合格；7）如在4-7天内出现问题，需提供前三天照片及详细操作步骤，由技术人员判定责任后可重发。技术人员若判定为双方责任的，由双方协商处理或者按合同价的50%收费重发。

对于不予重发的情况包括1）客户造成的细胞污染；2）客户不当操作导致细胞状态不良；3）非本库推荐的细胞培养体系导致的细胞状态不良；4）细胞状态不佳未提供前3天照片；5）细胞培养时经其它处理；6）收到细胞2天内未告知；7）其他视具体情况而定。

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